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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010399422.6 (22)申请日 2020.05.12 (71)申请人 深圳市星蝶科技有限公司 地址 518103 广东省深圳市宝安区石岩街 道龙腾社区松白公路北侧方正科技工 业园研发楼406 (72)发明人 艾卉钱凯谭毅彬朱韶凯 (74)专利代理机构 北京盛凡智荣知识产权代理 有限公司 11616 代理人 李娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) (54)发明名称 一种用于检测-地中海贫血的PCR试剂及 试剂盒 (57)摘要 本发明提供。

2、一种用于检测-地中海贫血的 PCR试剂及试剂盒， 该PCR试剂通过采用高耐受性 直扩PCR酶对-地中海贫血检测全血样品进行 扩增， 无需提取样品中的基因组DNA， 利用该PCR 试剂获得的检测试剂盒， 缩短了检测人员整个检 测时间， 大大节约了时间成本， 同时因为减少了 DNA提取和纯化过程， 减少了影响检测准确性的 因素， 大大提高了检测结果的准确性。 权利要求书1页 说明书19页 附图2页 CN 111593112 A 2020.08.28 CN 111593112 A 1.一种用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 其特征在于， 包括高耐受性直扩PCR酶， 缓冲 液， dNTP混合物， P。

3、CR增强剂， 以及用于扩增待检测样品中 珠蛋白基因片段的PCR引物， 所述 珠蛋白基因片段含有与 珠蛋白基因突变探针发生特异性杂交的DNA序列。 2.根据权利要求1所述的用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 其特征在于， 所述PCR引物 包括两对引物， 分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。 3.根据权利要求1所述的用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 其特征在于， 所述PCR增强 剂包括二甲基亚砜、 甘油、 甲酰胺、 氯化四甲铵、 谷氨酸钾和硫酸铵。 4.根据权利要求1所述的用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 其特征在于， 。

4、所述PCR引物 的终浓度为0.4 m-0.8 m。 5.一种用于检测 -地中海贫血的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 以及用于检测 -地中海贫血的核酸杂交膜条和杂交试剂。 6.根据权利要求5所述的用于检测 -地中海贫血的试剂盒， 其特征在于， 所述用于检测 -地中海贫血的核酸杂交膜条包括一尼龙膜基底， 以及固定于所述尼龙膜基底上的 珠蛋 白基因突变探针和对应的 珠蛋白基因正常探针， 所述 珠蛋白基因突变探针选自SEQ ID NO.5SEQ ID NO.21中的至少一个DNA序列或其反向互补序列， 所述 珠蛋白基因正常探针 选自SEQ ID NO.。

5、22SEQ ID NO.32中的至少一个DNA序列或其反向互补序列。 7.根据权利要求6所述的用于检测 -地中海贫血的试剂盒， 其特征在于， 所述 珠蛋白 基因突变探针和所述 珠蛋白基因正常探针在5 端或3 端带有氨基标记， 所述尼龙膜基底 带有羧基标记， 所述 珠蛋白基因突变探针和所述 珠蛋白基因正常探针通过共价结合固定 在所述尼龙膜基底上。 8.根据权利要求5所述的用于检测 -地中海贫血的试剂盒， 其特征在于， 所述杂交试剂 包括裂解液、 洗膜缓冲液、 生物素抗体和显色液。 9.根据权利要求8所述的用于检测 -地中海贫血的试剂盒， 其特征在于， 所述生物素抗 体为过氧化物酶， 所述显色液为。

6、四甲基联苯胺。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111593112 A 2 一种用于检测 -地中海贫血的PCR试剂及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物医药诊断领域， 尤其涉及一种用于检测 -地中海贫血的PCR试剂 及试剂盒。 背景技术 0002 -地中海贫血是由血红蛋白四聚体形式的 珠蛋白合成减少或合成缺乏引起的， 根据临床症状和血液学特征分为： -地中海贫血携带者状态， 中间型地中海贫血和重型地 中海贫血。 -地中海贫血的携带者状态是由 -地中海贫血的杂合性引起的， 在临床上无症 状， 并由特定的血液学特征定义。 重型地中海贫血是严重的输血依赖性贫血， 中间型地中海 贫血严重程度从。

7、无症状携带者状态到严重输血依赖性贫血类型。 0003 -地中海贫血在分子水平上是异质的。 迄今为止， 已经鉴定出200多种致病突变。 大多数突变是导致移码的寡核苷酸的单核苷酸取代、 缺失或插入。 中国人群中有5种常见的 突变， 以CD17(AT)， -28M(AG)、 CD41/42(-TTCT)、 IVS-II-654(CT)、 CD71/72(+A)居多， 占所有突变类型的90。 由于某些人群中 珠蛋白基因突变携带率高， 故胎儿遗传到 珠蛋 白突变基因的概率也高。 随着科技的发展， 通过早期分子诊断以及遗传咨询和产前诊断， 可 以使具有生育风险的夫妇对其生育选择做出明智的决定。 0004 。

8、-地中海贫血的传统检测方法有血常规参数检测分析、 红细胞渗透脆性试验、 血 红蛋白电泳试验等， 这些检测方法的特异性不高， 较易产生假阴性。 随着生物技术的发展， 诞生了一些特异性高的分子诊断方法， 例如TaqMan探针技术、 寡核苷酸探针杂交、 变性高效 液相色谱技术、 多重连接酶依赖的探针扩增技术、 基因芯片等， 但是这些技术均需要提取外 周血、 绒毛、 羊水中的DNA， DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素， 直接影响后续试 验。 而提取与纯化DNA时极易受污染， 使得检测结果易出现假阴性或者假阳性， 且DNA的提取 和纯化时间约1-2h， 检测过程耗费时间长。 发明内容 000。

9、5 本发明的一个目的在于提供一种用于检测 -地中海贫血的PCR试剂； 本发明的另 一个目的在于提供一种用于检测 -地中海贫血的试剂盒。 本发明使得在 -地中海贫血检测 过程中免去DNA提取和纯化过程， 提高了检测结果的准确性， 并且节约检测耗费时间。 0006 一方面， 本发明提供一种用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 包括高耐受性直扩 PCR酶， 缓冲液， dNTP混合物， PCR增强剂， 以及用于扩增待检测样品中 珠蛋白基因片段的 PCR引物， 所述 珠蛋白基因片段含有与 珠蛋白基因突变探针发生特异性杂交的DNA序列。 0007 在一些实施例中， PCR引物包括两对引物， 分别为SEQ 。

10、ID NO.1和SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。 0008 在一些实施例中， 所述PCR增强剂包括二甲基亚砜、 甘油、 甲酰胺、 氯化四甲铵、 谷 氨酸钾和硫酸铵。 0009 在一些实施例中， 所述PCR引物的终浓度为0.4 m-0.8 m。 说明书 1/19 页 3 CN 111593112 A 3 0010 另一方面， 本发明提供一种用于检测 -地中海贫血的试剂盒， 包括上述用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 以及用于检测 -地中海贫血的核酸杂交膜条和杂交试剂。 0011 在一些实施例中的， 所述用于检测 -地中海贫血的核酸杂交膜条包括一尼龙膜基。

11、 底， 以及固定于所述尼龙膜基底上的 珠蛋白基因突变探针和对应的 珠蛋白基因正常探 针， 所述 珠蛋白基因突变探针选自SEQ ID NO.5SEQ ID NO.21中的至少一个DNA序列或 其反向互补序列， 所述 珠蛋白基因正常探针选自SEQ ID NO.22SEQ ID NO.32中的至少 一个DNA序列或其反向互补序列。 0012 在一些实施例中的， 所述 珠蛋白基因突变探针和所述 珠蛋白基因正常探针在5 端或3 端带有氨基标记， 所述尼龙膜基底带有羧基标记， 所述 珠蛋白基因突变探针和所述 珠蛋白基因正常探针通过共价结合固定在所述尼龙膜基底上。 0013 在一些实施例中的， 所述杂交试剂。

12、包括裂解液、 洗膜缓冲液、 生物素抗体和显色 液。 0014 在一些实施例中的， 所述生物素抗体为过氧化物酶， 所述显色液为四甲基联苯胺。 0015 本发明的有益效果： 0016 解决了现有的 -地中海贫血检测试剂盒必须从样本中提取基因组DNA， 而且必须 是高质量的DNA， 从而影响检测准确性以及检测时间长的问题； 本发明试剂盒无需提取样品 中的基因组DNA， 全血即可用于PCR扩增模板， 从而缩短了检验人员整个检验时间， 大大节约 了时间成本， 提高了检测准确性。 附图说明 0017 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当理解， 以。

13、下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对 本发明范围的限定。 0018 图1为PCR扩增产物凝胶电泳图。 一共有五个全血样品， 其中1-5号泳道是用传统方 法先进行基因组DNA提取纯化再进行PCR扩增后的电泳结果， 6-10号泳道是对应的本发明提 供的PCR试剂扩增全血样品后的电泳结果， 阴性对照是以无菌水为模板扩增的电泳结果， 阳 性对照是以正常无突变的基因组DNA为模板扩增的电泳结果。 DNAmarker为1000bpLadder。 0019 图2-图4为本发明的 -地中海贫血检测试剂盒检测全血样品结果图。 0020 图2为1-2号全血样品检测结果图。 0021 图3为3-4。

14、号全血样品检测结果图。 0022 图4为5号全血样品检测结果图。 0023 图5为全血样品检测结果的阳性对照Y和阴性对照N。 具体实施方式 0024 本文中所用的术语 “包含” 、“包括” 、“具有” 、“含有” 或其任何其它变形， 意在覆盖 非排它性的包括。 例如， 包含所列要素的组合物、 步骤、 方法、 制品或装置不必仅限于那些要 素， 而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、 步骤、 方法、 制品或装置所固有的 要素。 0025 连接词 “由组成” 排除任何未指出的要素、 步骤或组分。 如果用于权利要求中， 说明书 2/19 页 4 CN 111593112 A 4 此短语将使权利。

15、要求为封闭式， 使其不包含除那些描述的材料以外的材料， 但与其相关的 常规杂质除外。 当短语 “由组成” 出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后 时， 其仅限定在该子句中描述的要素； 其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之 外。 0026 当量、 浓度、 或者其它值或参数以范围、 优选范围、 或一系列上限优选值和下限优 选值限定的范围表示时， 这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围 下限或优选值的任一配对所形成的所有范围， 而不论该范围是否单独公开了。 例如， 当公开 了范围 “15” 时， 所描述的范围应被解释为包括范围 “14” 、“13” 、“12” 、“。

16、12和4 5” 、“13和5” 等。 当数值范围在本文中被描述时， 除非另外说明， 否则该范围意图包括其端 值和在该范围内的所有整数和分数。 0027 本发明提供一种用于检测 -地中海贫血的PCR试剂， 包括高耐受性直扩PCR酶， 缓 冲液， dNTP混合物， PCR增强剂， 以及用于扩增待检测样品中 珠蛋白基因片段的PCR引物， 所 述 珠蛋白基因片段含有与 珠蛋白基因突变探针发生特异性杂交的DNA序列。 0028 本发明涉及到的 珠蛋白突变基因检测位点包括： -32M、 -30M、 -29M、 -28M、 IntM、 14/15M、 17M、 EM、 27/28M、 IVS-I-1M、 I。

17、VS-I-5M、 31M、 41/42M、 43M、 71/72M、 IVS-II-654M、 CAP17个位点。 0029 高耐受性直扩PCR酶是从文库中筛选出来的具有极高耐受性的Taq或者Klentaq突 变体， 可以直接以全血、 血清、 土壤、 牛奶、 巧克力或奶酪等材料为模板一步扩增目的基因， 避免了繁琐的核酸DNA提取过程。 高耐受性直扩PCR酶可以通过购买获得， 也可以通过基因 改造获得。 0030 具体的， 所述PCR引物包括两对引物， 分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。 SEQ ID NO.3和SEQ ID 。

18、NO.4的扩增产物用于检测654M位点， SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的扩增产物用于检测除654位点以外的其它突变位点， PCR引物具体序 列如下表1： 0031 表1 不同长度的 珠蛋白基因片段PCR引物DNA序列 0032 序列编号引物名称序列(5 -3 ) SEQ ID NO.1leftwardprimer-FGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA SEQ ID NO.2leftwardprimer-RTCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAAC SEQ ID NO.3rightwardprimer-FGTGTACACATATTGACCAAA SE。

19、Q ID NO.4rightwardprimer-RTGATACTTGTGGGCCAGGGCATTA 0033 具体的， 所述PCR增强剂包括二甲基亚砜、 甘油、 甲酰胺、 氯化四甲铵、 谷氨酸钾和 硫酸铵。 0034 更具体的， 所述PCR引物的终浓度为0.4 m-0.8 m。 0035 本发明还提供一种用于检测 -地中海贫血的试剂盒， 包括上述用于检测 -地中海 贫血的PCR试剂， 以及用于检测 -地中海贫血的核酸杂交膜条和杂交试剂。 0036 具体的， 所述用于检测 -地中海贫血的核酸杂交膜条包括一尼龙膜基底， 以及固 定于所述尼龙膜基底上的 珠蛋白基因突变探针和对应的 珠蛋白基因正常探。

20、针， 所述 珠 蛋白基因突变探针选自SEQ ID NO.5SEQ ID NO.21中的至少一个DNA序列或其反向互补 序列， 所述 珠蛋白基因正常探针选自SEQ ID NO.22SEQ ID NO.32中的至少一个DNA序列 说明书 3/19 页 5 CN 111593112 A 5 或其反向互补序列。 0037 具体的， 所述 珠蛋白基因突变探针和所述 珠蛋白基因正常探针在5 端或3 端带 有氨基标记， 所述尼龙膜基底带有羧基标记， 所述 珠蛋白基因突变探针和所述 珠蛋白基 因正常探针通过共价结合固定在所述尼龙膜基底上。 0038 具体的， 所述杂交试剂包括裂解液、 洗膜缓冲液、 生物素抗体。

21、和显色液。 0039 具体的， 所述生物素抗体为过氧化物酶， 所述显色液为四甲基联苯胺。 0040 更具体的， 所述洗膜缓冲液包括A液2柠檬酸钠缓冲液、 B液0.5柠檬酸钠缓冲 液和C液0.1M的柠檬酸钠缓冲液。 0041 更具体的， 在100mL20柠檬酸钠缓冲液中加10mL10SDS用双蒸水定容到1000mL 得到A液， 在25mL20柠檬酸钠缓冲液中加10mL10SDS用双蒸水定容到1000mL得到B液， 在 100mL1M的柠檬酸钠缓冲液中加纯水定容至1000mL得到C液。 0042 下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员 将会理解， 下列实施例仅用于。

22、说明本发明， 而不应视为限制本发明的范围。 实施例中未注明 具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规产品。 0043 实施例1用于检测 -地中海贫血的核酸杂交膜条的制备 0044 1、 探针的制备 0045 按照表2中的序列合成 珠蛋白基因突变探针， 反向互补序列的探针具有与表中序 列相同的效果， 在此表中不再一一列出， 按照表3中的序列合成 珠蛋白基因正常探针， 珠 蛋白基因正常探针与 珠蛋白基因突变探针的对应关系如表3。 在本实施例中N代表正常型， M代表突变型。 对探针的5 端或3 端进行氨基标记效果相同， 在本。

23、实施例中为统一方便所有 的探针均进行5 端氨基标记， 合成的方法为常规的DNA合成法。 0046 表2 珠蛋白基因突变探针的DNA序列 0047 序列编号探针名称突变探针序列(5 -3 ) SEQ ID NO.5-32MCTGACTTTTGGTGCCC SEQ ID NO.6-30MCCTGACTTTTGTGCCC SEQ ID NO.7-29MCCCTGACTTTCATGCCC SEQ ID NO.8-28MCCCTGACTTCTATGCCC SEQ ID NO.9IntMGGTGCACCCTGGTGTCT SEQ ID NO.1014/15MCCCTGGTGGGGCAAGG SEQ ID 。

24、NO.1117MGTGGGGCTAGGTGAAC SEQ ID NO.12 EM TTGGTGGTAAGGCCCT SEQ ID NO.1327/28MGGTGAGGCCCCTGG SEQ ID NO.14IVS-I-1MCTGGGCAGTTTGGTAT SEQ ID NO.15IVS-I-5MGCAGGTTGCTATCAAG SEQ ID NO.1631MATACCAACTTGCCCAGG SEQ ID NO.1741/42MCAAAGGACTCAACCTCTGG SEQ ID NO.1843MCCCAGAGGTTCTTTTAGTC SEQ ID NO.1971/72MGGTGCCTTTAA。

25、GTGATG 说明书 4/19 页 6 CN 111593112 A 6 SEQ ID NO.20IVS-II-645MATTGCTATTACCTTAACCC SEQ ID NO.21CAPAAATGGAAGCAATAGATGG 0048 表3 珠蛋白基因正常探针的DNA序列 0049 0050 2、 核酸杂交膜条的制备 0051 完成探针的合成之后， 需要将探针固定在尼龙膜上。 将带负电的尼龙膜按需要切 成所需的大小尺寸， 对于本实施例中10个正常探针和突变探针， 检测一个样品的膜条大小 为62cm， 用0.1M HCl冲洗， 并用16的1-乙基-3碳二亚胺盐酸盐处理15分钟， 然后用蒸馏 。

26、水冲洗并吸干， 激活表面羧基。 0052 将氨基修饰的探针稀释到4pmol的浓度， 用自动移液器将1.5 l的正常探针和突变 探针分别点在每个膜条的同一位置的上排和下排， 方便检测 珠蛋白基因杂合突变的情况， 通过氨基和羧基的共价结合将探针固定在膜条上。 最后用封阻液处理尼龙膜， 封闭未结合 探针的表面羧基， 核酸杂交膜条制作完成。 本实施例中核酸杂交膜条探针标记如下表4。 0053 表4 膜条上的探针固定位置 0054 41/42N654N-28N71/72N17N EN 31N27/28M 41/42M654M-28M71/72M17M EM 31MIVS-I-1M 43M-32M-29M。

27、-30M14/15MCAPIntMIVS-I-5M 0055 实施例2用于扩增待检测样品中 珠蛋白基因的PCR引物的设计 0056 从NCBI上查找 珠蛋白基因核苷酸序列(GenBank:AH001475.2)， 并且按照引物设 计原则， 用两对特异性、 具有不同长度和Tm值、 并且在5 端含有生物素标记的PCR引物扩增 珠蛋白基因的两个片段。 这两对引物的核苷酸序列见表5， 其中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4 的扩增产物可与654N和/或654M探针杂交， 用于检测654位点突变， SEQ ID NO.1和SEQ ID 说明书 5/19 页 7 CN 111593112 A 。

28、7 NO.2的扩增产物用于检测除654位点以外的其它位点的突变。 0057 表5 不同长度的 珠蛋白基因片段PCR引物DNA序列 0058 序列编号引物名称序列(5 -3 ) SEQ ID NO.1Left-Primer-FGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA SEQ ID NO.2Left-Primer-RTCATTCGTCTGTTTCCCATTCTAAAC SEQ ID NO.3Right-Primer-FGTGTACACATATTGACCAAA SEQ ID NO.4Right-Primer-RTGATACTTGTGGGCCAGGGCATTA 0059 实施例3待检测样品。

29、的PCR扩增 0060 用omniTaq酶(购自美国VitaNaviTechnology公司)对全血样本进行PCR扩增， 同时 按照常规方法提取全血中的基因组DNA并且用普通Taq酶对样本DNA进行扩增来做对照， 同 时以未突变的野生型DNA为模板扩增作为阳性对照， 以无菌水为模板扩增作为阴性对照。 扩 增体系如下表6， 扩增条件如表7。 扩增完成后， 分别取5uL进行1琼脂糖凝胶电泳， 结果如 图1所示， 其中1-5号泳道是用传统方法先进行基因组DNA提取纯化再进行PCR扩增后的电泳 结果， 6-10号泳道是对应的本发明提供的PCR试剂扩增全血样品后的电泳结果。 从图中可看 出1-10号泳道。

30、以及阳性对照均有两条扩增条带， 分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物对 的扩增产物704bp和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物对的扩增产物523bp。 证明高耐受性直 扩PCR酶以全血样品为模板扩增目的基因与传统的提取纯化DNA进行PCR扩增的效果一样 好， 但是以全血样品为模板省去了提取纯化DNA的过程， 大大节约了检测时间， 同时检测结 果也不受DNA质量的影响， 提高检测准确性。 0061 表6.扩增体系 0062 0063 表7.扩增条件 0064 0065 实施例4实施例3得到的PCR产物与实施例1得到的膜条进行杂交 0066 1、 膜条准备： 。

31、根据PCR的反应管数， 取出相应数量的膜条和杂交管。 在膜条上用中 说明书 6/19 页 8 CN 111593112 A 8 性笔编号后放入杂交管中， 加入8mL的A液， 以膜条完全浸没为准； 取25 L对应编号的实施例 3得到的PCR产物加入管中液面以下， 拧紧管盖。 0067 2、 DNA变性： 将杂交管置100水浴中变性10min。 (杂交液面要浸没在水浴液面以 下。 ) 0068 3、 杂交： 将杂交管放入杂交仪中， 42杂交1.5小时。 同时将装有40mL B液的50mL 杂交管放入杂交仪中预热， 每管B液最多洗8张膜条， 根据样本数量的多少放置相应的B液管 数量。 0069 4、。

32、 洗膜： 将膜条取出， 放入装有常温B液的小烧杯中涮洗一下， 然后将膜条快速转 移到已预热至42， 装有B液的杂交管中。 快速放入杂交仪， 于42摇洗5min。 0070 5、 抗体孵育： 将孵育液按照A液： 过氧化物酶10000:1的比例配制在50mL的杂交 管中， 将膜条放入孵育液中室温轻摇孵育30min。 当膜条数目8时， 20mLA液加2 L过氧化物 酶配成20ml孵育液； 当膜条数目8时， 按1张膜条0.2 L过氧化物酶的比例配制孵育液。 0071 6、 洗膜： 将膜条转入装有40mLA液的杂交管中， 室温轻摇洗涤两次每次5min。 0072 7、 显色： 将膜条放入装有C液的杂交管。

33、中， 室温摇洗2min； 同时配制显色液： 19mLC 液+1mL四甲基联苯胺+2 L30H2O2； 将膜条浸没于显色液中避光显色15min， 再将膜条转移 至蒸馏水中涮洗一下， 即可观察实验结果。 20mL显色液最多显色8张膜条； 当膜条数目8 时， 按1张膜条2mLC液的比例配制显色液。 0073 8、 结果判断： 依据显色信号的有无和位置判断相应的 -地中海贫血基因型， 5个检 测样品与野生型对照以及阴性对照结果如图2-图5。 0074 图2为1、 2号全血样品检测结果， 根据图2结果可知， 1号为 珠蛋白基因71/72位点 纯合突变的患者， 2号为 珠蛋白基因71/72位点杂合突变的患。

34、者。 图3为3、 4号全血样品检测 结果， 根据图3可知， 3号为 珠蛋白基因654位点杂合突变的患者， 4号为 珠蛋白基因17位点 杂合突变的患者。 图4为5号全血样品检测结果， 根据图4可知， 5号为 珠蛋白基因IVS-I-1位 点纯合突变的患者。 图5分别为野生型DNA检测结果和阴性对照。 0075 最后应说明的是： 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽 管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依 然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分或者全部技术特征进 行等同替换； 而这些修改或者替换， 并不使相应。

35、技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围。 0076 此外， 本领域的技术人员能够理解， 尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所 包括的某些特征而不是其它特征， 但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围 之内并且形成不同的实施例。 例如， 在上面的权利要求书中， 所要求保护的实施例的任意之 一都可以以任意的组合方式来使用。 公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明 的总体背景技术的理解， 而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技 术人员所公知的现有技术。 说明书 7/19 页 9 CN 111593112 A 9 0077 说明书 8/19 页 10 CN。

36、 111593112 A 10 0078 说明书 9/19 页 11 CN 111593112 A 11 0079 说明书 10/19 页 12 CN 111593112 A 12 0080 说明书 11/19 页 13 CN 111593112 A 13 0081 说明书 12/19 页 14 CN 111593112 A 14 0082 说明书 13/19 页 15 CN 111593112 A 15 0083 说明书 14/19 页 16 CN 111593112 A 16 0084 说明书 15/19 页 17 CN 111593112 A 17 0085 说明书 16/19 页 18 CN 111593112 A 18 0086 说明书 17/19 页 19 CN 111593112 A 19 0087 说明书 18/19 页 20 CN 111593112 A 20 0088 说明书 19/19 页 21 CN 111593112 A 21 图1 图2 说明书附图 1/2 页 22 CN 111593112 A 22 图3 图4 图5 说明书附图 2/2 页 23 CN 111593112 A 23 。